本网讯 近日，中南大学资源加工与生物工程学院微生物制造团队在国际知名期刊《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed.）上发表非天然氨基酸微生物合成最新研究成果，题为“Hydrophilicity-Based Engineering of the Active Pocket of D-Amino Acid Oxidase Leading to Highly Improved Specificity toward D-Glufosinate”。中南大学资源加工与生物工程学院为论文唯一完成单位，博士研究生杨凯为第一作者，曾伟民教授为通讯作者。

传统除草剂草甘膦、百草枯等的大量使用所带来的环境和安全问题引起了国内外广泛关注。而草铵膦(PPT)由于具有更好的除草活性以及较低的环境压力，更受市场青睐，正在逐步替代传统除草剂。目前商业化草铵膦通常由D，L-草铵膦的混合物组成，但只有L-草铵膦具有除草活性，因此通过将D-草铵膦转化为L-草铵膦，能够减少草铵膦除草剂一半用量，同时还可以减少化学物质对土壤板结、作物健康的危害。目前D-草铵膦转化为L-草铵膦的方法主要有化学法和生物法，但普遍存在成本高、效率低的问题。

该团队针对目前L-草铵膦生物合成法中酶活低、产品纯度不高的难题，开展生物合成过程中关键酶改造及酶活提升研究。D-氨基酸氧化酶(DAAO)因其严格的立体特异性而被广泛应用于合成L-氨基酸。然而，野生型DAAO难以识别非天然底物如D-草铵膦(D-PPT)，从而限制了其工业应用。针对该挑战，该团队通过计算机辅助模拟酶分子与底物对接过程，确定了10个位于活性口袋附近的氨基酸残基，并采用亲水性氨基酸替换以及定点饱和测试/迭代定点突变策略(CAST/ISM)，对红酵母DAAO (RgDAAO)进行定向进化实验，获得的最佳突变体(N54T/M213T/S335Q)对D-PPT的活力提高了超过2000倍，且具有良好的温度和pH稳定性。该突变体在D, L-PPT的转化实验中展现出远高于野生型RgDAAO的优秀催化能力，是目前对于D-PPT具有最高催化活力的DAAO突变株。该研究成功建立起从外消旋PPT到PPO (L-PPT的前体)的高效生物催化路线，同时研究中所采用的亲水性替换饱和突变策略也为非天然氨基酸的生物合成提供了新观点。

高效DAAO酶和另外一种关键酶的成功开发将实现L-草铵膦低成本生物合成的技术突破，预计L-草铵膦生产成本降低30%以上，有望推动绿色高效除草剂L-草铵膦在我国的大规模推广应用。