本网讯 近日，中南大学医学遗传学研究中心梁德生教授团队在成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白12a（Cas12a）核酸检测技术研究中取得新进展，题为“基于单链DNA修饰CRISPRRNA的Cas12a一步法灵敏、可视化的检测新冠病毒（Sensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using RPA-Cas12a one-step assay with ssDNA-modified crRNA）”的研究成果在化学领域国际权威期刊《分析化学学报》（ANALYTICA CHIMICA ACTA）上发表。中南大学硕士研究生曾钦龙、南华大学周妙金教授和中南大学硕士研究生邓巍衡为该论文的共同第一作者，梁德生教授、邬玲仟教授和李卓教授为共同通讯作者，中南大学生命科学学院为第一通讯单位。本研究受国家自然科学基金、国家重点研发计划等项目支持。

CRISPR/Cas12a一步法已经广泛应用于病原体核酸的检测。但是，在一步法反应中，Cas12a蛋白会与等温扩增竞争并剪切目标基因，从而导致该方法的检测能力下降。因此，提升一步法灵敏度的关键是平衡等温扩增与CRISPR检测。在此前的研究中，该团队发现单链DNA修饰crRNA在一步法核酸检测中的灵敏度比野生型crRNA提高了100倍以上。并且，修饰crRNA比野生型crRNA具有更好的稳定性。研究人员利用修饰crRNA开发了快速、高灵敏检测DNA病原体的Cas12a一步法核酸检测技术（命名为CasDOS）。然而，该技术灵敏度提高的机制仍不清楚。

本研究中，梁德生教授团队深入探索单链DNA修饰crRNA介导的Cas12a一步法核酸检测的反应机制，并将该方法拓展至RNA病原体的检测。机制研究发现，修饰crRNA在一步法反应中具有更好的检测性能是由于其3’末端添加的DNA减弱了Cas12a-修饰crRNA复合物与目标DNA的亲和力，导致Cas12a顺式、反式剪切活性的降低，这种改变使得Cas12a减少了对目标DNA的剪切，一步法反应有更多的目标DNA得以扩增和积累，最终提升了检测能力。此外，通过对检测体系的全方位优化，研究人员成功将该方法应用于新冠病毒的特异性检测，灵敏度达到5aM，并可在紫外灯下可视化观察结果。临床标本试验中，该方法检测40例新冠病毒标本与荧光定量PCR的结果一致性为97.5%。

CasDOS检测新冠病毒工作流程及其反应机制示意图

该研究阐明了单链DNA修饰crRNA介导的Cas12a一步法核酸检测技术的反应机制，为解决一步法反应中等温扩增和CRISPR检测之间的不兼容性问题提供重要指导意义。同时该研究进一步拓展了CasDOS技术的应用范围，建立了高灵敏度、高特异性、可视化的新冠病毒检测体系。

（一审：张贝 二审：王轩 三审：李殷）