本网讯  医学遗传学国家重点实验室梁德生课题组最近在Scientific Reports上发表论文，报道了一种针对人凝血因子VIII（FVIII）基因大倒位的定点修复策略。该技术有望为重度血友病的基因治疗策略提供新的思路，同时也对类似大基因片段的定点修复研究具有一定的启发。

血友病A是最常见的X连锁隐性出血性遗传病，在出生男婴中的发病率约为1/5000。主要症状为自发出血或创伤后流血不止，重度患者具有一定的致残致死性。该病目前还无法根治，临床上主要采取终身替代治疗，花费巨大且存在一些潜在危险。基因治疗是血友病A的终极理想策略，然而编码这一蛋白的F8是一个很大的基因（186kb），仅仅cDNA就长达9kb，这在技术上造成了很大的障碍，导致目前血友病A的基因治疗研究还没有取得突破。

目前已报道的导致血友病的F8突变有两千多种类型。虽然F8的突变类型如此复杂，但是在重度血友病A患者当中，约有45%的患者都是由同一种突变导致，即22号内含子倒位。这是一种倒位片段长达600kb的染色体内大片段倒位，直接导致F8被完全打乱。研究针对这种突变的基因治疗策略有可能使大量的血友病A患者受益，因此具有重要的意义。

这种染色体大片段倒位的直观的后果就是将186kb的F8从22号内含子处完全分割成转录方向相反的两段。上游的部分（141kb）完全保留了启动子区和前面22个外显子的信息，但是与包含最后四个外显子的下游片段完全脱节。通过比对发现，在45kb的下游片段中所包含的编码序列仅有627bp。由此，研究人员设计了一种针对性的原位修复策略，就是将这627bp的编码序列连同一个polyA信号定点靶入到22号外显子后面，从而通过片段添加的方式将141kb片段缺少的遗传编码信息补齐。亦即将这个141kb的截断片段原位拯救成一个完整的表达框，进而在原来的F8启动子调控下表达。为了验证这一策略的可行性，研究人员收集了22号内含子倒位血友病A患者的细胞，将其重编程为iPS细胞。在TALENs的促进下，成功将仅仅0.9kb的修复片段高效定点地靶入到了22号外显子和22号内含子的交界处。将修复后的iPS细胞定向分化成内皮细胞和间充质干细胞后发现，F8的转录以及FVIII蛋白的分泌都得到了纠正，并且分泌的FVIII具有正常的凝血功能。

这项研究的意义并不局限在于血友病A基因治疗领域。其更重要的价值在于这个策略仅仅通过定点靶入很小的片段就实现了大片段染色体倒位的定点原位修复。这为其他大基因的原位修复策略提供了重要的参考，即通过合理的设计，只需要较小的序列改动就能够实现大基因片段突变的功能性修复。  

参考文献：  

Wu Y et al, In situ genetic correction ofF8 intron 22 inversion in hemophilia A patient-specific iPSCs. Sci Rep. 2016Jan 8;6:18865. doi: 10.1038/srep18865.